การจำแนก Psilocybe cubensis แบบหลายตำแหน่งโดยการหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM) (2024)

  • รายการวารสาร
  • นิติวิทยาศาสตร์ Res
  • ข้อ 7(3); 2022
  • PMC9639532

ในฐานะห้องสมุด NLM จัดให้มีการเข้าถึงวรรณกรรมทางวิทยาศาสตร์ การรวมไว้ในฐานข้อมูล NLM ไม่ได้หมายความถึงการรับรองหรือข้อตกลงกับเนื้อหาโดย NLM หรือสถาบันสุขภาพแห่งชาติ
เรียนรู้เพิ่มเติม:ข้อจำกัดความรับผิดชอบของ PMC|ประกาศเกี่ยวกับลิขสิทธิ์ PMC

การจำแนก Psilocybe cubensis แบบหลายตำแหน่งโดยการหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM) (1)

Link to Publisher's site

นิติวิทยาศาสตร์ Res.2022; 7(3): 490–497.

เผยแพร่ออนไลน์ 2021 13 เมษายน ดอย:10.1080/20961790.2021.1875580

PMCID:PMC9639532

PMID:36353314

เสี่ยวฉุน จาง,ก,, ฮวน ยู,ก,, จือเว่ย หวัง,ก,, ชี่หยาง,ก,, รัวเฉิงเซี่ย,ข,, อี้หลิงฉู่,ก,, รุยหยางเต๋า,ข,, หยานซี, ปิงเซียง, ซูฮวา จาง,และเฉิงเต่า ลี่ก,,

ข้อมูลผู้เขียน ข้อมูลลิขสิทธิ์และใบอนุญาต ข้อจำกัดความรับผิดชอบของ PMC

ข้อมูลที่เกี่ยวข้อง

วัสดุเสริม

เชิงนามธรรม

เห็ดหลอนประสาทเป็นสายพันธุ์พิษชนิดหนึ่งที่มีสารทริปตามีนออกฤทธิ์ต่อจิตประสาท เช่น แอลเอสโลไซบิน ไซโลซิน และกรดไอโบเทนิก เป็นต้น เห็ดที่มีส่วนประกอบของสารหลอนประสาทมีความหลากหลาย มีการกระจายอย่างกว้างขวาง และขาดมาตรฐานในการกำหนด ซึ่งถือเป็นความท้าทายอย่างมากในการระบุตัวตน วิธีการระบุแบบดั้งเดิม เช่น สัณฐานวิทยาและการวิเคราะห์พิษวิทยา แสดงให้เห็นข้อบกพร่องในตัวอย่างเก่าหรือตัวอย่างที่ผ่านการแปรรูป ในขณะที่การระบุเห็ดหลอนประสาทโดยใช้ DNA จะช่วยให้สามารถระบุตัวอย่างเหล่านี้ได้เนื่องจากความเสถียรของ DNA ในบทความนี้ ชุดไพรเมอร์สี่ชุดได้รับการออกแบบมาเพื่อกำหนดเป้าหมายPsilocybe cubensisDNA สำหรับการเพิ่มความละเอียดของวิธีการระบุตัวตนในปัจจุบัน และเครื่องหมายเป้าหมายประกอบด้วยหน่วยย่อยที่ใหญ่ที่สุดของ RNA polymerase II (ทำเครื่องหมายเป็น PC-R1), ยีนฟอสโฟทรานสเฟอเรสที่เกี่ยวข้องกับแอลเอส (ทำเครื่องหมายเป็น PC-PT), กลีเซอรัลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส (ทำเครื่องหมายเป็น PC -3) และการแปล EF1α (ทำเครื่องหมายเป็น PC-EF) PCR แบบเรียลไทม์พร้อมการทดสอบการหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM) ถูกนำมาใช้สำหรับการแยกส่วนของชิ้นส่วนที่ถูกขยายโดยชุดไพรเมอร์เหล่านี้ ซึ่งได้รับการทดสอบสำหรับความจำเพาะ ความสามารถในการทำซ้ำ ความไว การวิเคราะห์ของผสม และ PCR แบบมัลติเพล็กซ์ พบว่าอุณหภูมิหลอมเหลวของ PC-R1, PC-PT, PC-3 และ PC-EF ของพี. คิวเบนซิสคือ (87.93 ± 0.12) °C, (82.21 ± 0.14) °C, (79.72 ± 0.12) °C และ (80.11 ± 0.19) °C ในการทดลองอิสระประเภทต่างๆ ของเรา คุณลักษณะ HRM ที่สำคัญสามารถแสดงได้ด้วยตัวอย่าง DNA ที่มีความเข้มข้นต่ำ 62.5 pg/µL และพี. คิวเบนซิสสามารถตรวจพบได้ในสารผสมด้วยเป็นคนฉลาดหรือกัญชา sativa. โดยสรุป วิธีการวิเคราะห์ HRM สามารถแยกแยะได้อย่างรวดเร็วและเฉพาะเจาะจงพี. คิวเบนซิสจากสายพันธุ์อื่นที่สามารถนำไปใช้ในด้านนิติวิทยาศาสตร์ การวินิจฉัยทางการแพทย์ และคดีค้ายาเสพติดได้

ข้อมูลเพิ่มเติมสำหรับบทความนี้มีอยู่ทางออนไลน์ที่https://doi.org/10.1080/20961790.2021.1875580.

คำสำคัญ:นิติวิทยาศาสตร์ นิติเวชศาสตร์ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) การหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM)Psilocybe cubensis, หลายสถานที่, เฉพาะสายพันธุ์

การแนะนำ

Psilocybe cubensis,Psilocybe merdaria,Panaeolus แห่งแอนทิลลิสและสายพันธุ์อื่นๆ ที่เกี่ยวข้องเรียกว่า “เห็ดศักดิ์สิทธิ์” หรือ “เห็ดหลอนประสาท” ซึ่งใช้มานานหลายร้อยปีในพิธีกรรมทางศาสนาบางอย่างของชาวเม็กซิกันพื้นเมือง [1] นิวโรทอกซินที่มีผลหลอนประสาทที่มีอยู่ในเห็ดเหล่านี้คือแอลเอสโลไซบิน ซึ่งส่วนใหญ่มีอยู่สี่สกุล:ไซโลไซบี,พานาโอลัส,โคโนไซบีและจิมโนปิลัส[2–4] นับตั้งแต่ทศวรรษ 1970 เป็นต้นมา เห็ดที่มีสารหลอนประสาทเหล่านี้มักถูกรับประทานโดยคนหนุ่มสาวในสหรัฐอเมริกา แคนาดา สหราชอาณาจักร เยอรมนี และประเทศอื่นๆ ในยุโรปเพื่อวัตถุประสงค์ในการพักผ่อนหย่อนใจ [5] อย่างไรก็ตาม การหมกมุ่นอยู่กับสารดังกล่าวในระยะยาวจะทำให้เกิดพิษต่อระบบประสาท และพฤติกรรมที่ไม่สามารถควบคุมได้จะนำไปสู่การก่อคดีอาญาได้ง่าย [6] เนื่องจากอาการประสาทหลอนที่เกิดจากแอลเอสและอารมณ์ที่รุนแรง การให้แอลเอสแอลโดยไม่ใช้ทางการแพทย์อาจทำให้เกิดพฤติกรรมที่เป็นอันตรายหรือแม้แต่การฆ่าตัวตายได้ [7,8] เพื่อป้องกันการเสียชีวิตจากยาเสพติดและสอบสวนคดีการค้ายาเสพติด การตรวจหาและระบุเห็ดที่ทำให้เกิดอาการประสาทหลอนจึงเป็นสิ่งจำเป็นอย่างยิ่งสำหรับการรักษาพยาบาลฉุกเฉินและการดำเนินคดีทางอาญา

การระบุชนิดพันธุ์เห็ดหลอนประสาทแบบดั้งเดิมได้ผ่านห้าขั้นตอน: สัณฐานวิทยา เซลล์วิทยา ชีวเคมี ภูมิคุ้มกันวิทยา และอณูชีววิทยา [9–11] อย่างไรก็ตาม วัสดุที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมที่แตกต่างกัน และระดับของการเปลี่ยนแปลงในการสูญเสียสภาพ การเสื่อมสภาพ และการเสียหายของวัสดุเหล่านี้อาจไม่อาจคาดเดาได้ ซึ่งทำให้งานระบุตัวตนยากขึ้น ในฐานะเทคโนโลยีการจำแนกชนิดพันธุ์ใหม่ การจำแนกตาม DNA ถือเป็นแนวทางใหม่สำหรับการศึกษาอนุกรมวิธาน และมีโอกาสนำไปใช้ในวงกว้างในด้านชีววิทยา การแพทย์ สุขอนามัยอาหาร นิติเวช และสาขาอื่นๆ [12–14] ตัวอย่างเช่น Internal Transcribed Spacer (ITS) และชิ้นส่วนของมัน ITS1 และ ITS2 มีความหลากหลายสูงระหว่างสปีชีส์ และมีลักษณะเป็นบาร์โค้ด DNA ที่เป็นสากลและมีประสิทธิภาพ [13,14] ขณะที่นูเจนต์ และ ซาวิลล์ [15] พบว่า nLSU rRNA (28S) มีฤทธิ์ในการจำแนกได้ดีกว่า ITS1 ในเห็ดที่มีสารหลอนประสาทและเห็ดที่ไม่มีสารหลอนประสาท นอกจากบาร์โค้ดเหล่านี้แล้ว ยังมีการเข้ารหัสโปรตีนอีกด้วยRPB1ถูกนำมาใช้ในการจำแนกและจำแนก Inocybe และ Agaricales และRPB2ได้ถูกนำมาใช้ร่วมกับ LSU และ SSU เพื่อศึกษาสายวิวัฒนาการของ Ascomycota [16,17] แม้ว่าจะมีการขุดค้นบริเวณต่างๆ มากขึ้นเรื่อยๆ เพื่อจำแนกชนิดพันธุ์ต่างๆ แต่ก็ยังไม่มีกลยุทธ์การระบุตัวตนที่สมบูรณ์ที่ได้รับการออกแบบมาเพื่อพี. คิวเบนซิส. ภูมิภาค ITS ถูกใช้อย่างกว้างขวางในการเลือกปฏิบัติพี. คิวเบนซิสในขณะที่ความเป็นสากลสูงส่งผลให้ความจำเพาะของสายพันธุ์ไม่เสถียร เครื่องหมาย DNA อื่นๆ ยังไม่ได้รับการศึกษาพี. คิวเบนซิสอย่างทั่วถึง วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อเลือกเครื่องหมายเฉพาะบางประการสำหรับพี. คิวเบนซิสและผสมผสานสิ่งเหล่านี้เข้าด้วยกัน เพื่อออกแบบกลยุทธ์การระบุตัวตนสำหรับโดยเฉพาะพี. คิวเบนซิสในสาขานิติวิทยาศาสตร์

การวิเคราะห์การหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM) เป็นวิธีที่ใช้ในการวิเคราะห์อย่างรวดเร็วของการแปรผันของลำดับ DNA ภายในแอมพลิคอน PCR ซึ่งแสดงพารามิเตอร์เส้นโค้ง HRM เฉพาะและอุณหภูมิหลอมละลาย (m) โดยการติดตามการเปลี่ยนแปลงของสารเรืองแสง [18–21] เทคโนโลยีนี้สามารถให้การวิเคราะห์โดยละเอียดเกี่ยวกับความแปรผันของนิวคลีโอไทด์ระหว่างแอมพลิคอนที่ได้มาจากสปีชีส์ต่างๆ ตัวอย่างเช่น PCR แบบเรียลไทม์ตามด้วยการทดสอบ HRM ได้รับการสาธิตเพื่อการระบุตัวตนพี. คิวเบนซิส,กัญชา sativa,มันจะให้ฟางและเมอร์เรเมียทูเบโรซ่าในปฏิกิริยา PCR แบบมัลติเพล็กซ์เพียงครั้งเดียว [2,19,20] ในการศึกษานี้ ชุดไพรเมอร์ 4 ชุดได้รับการออกแบบเพื่อกำหนดเป้าหมายพี. คิวเบนซิสและ PCR HRM แบบเรียลไทม์ได้ดำเนินการเพื่อวิเคราะห์คุณลักษณะของเครื่องหมายแต่ละตัว รวมถึงความจำเพาะ ความสามารถในการทำซ้ำ ความไว และประสิทธิภาพการระบุตัวตนในสารผสมและ PCR แบบมัลติเพล็กซ์ ไพรเมอร์ได้รับการทดสอบใน 22 ชนิด ได้แก่พี. คิวเบนซิส, เห็ดหรือพืชที่เกี่ยวข้อง และเป็นคนฉลาด. ผลปรากฏว่าสามารถแยกแยะวิธีการได้ชัดเจนพี. คิวเบนซิสจากสายพันธุ์อื่น ซึ่งเป็นกลยุทธ์ที่เชื่อถือได้ในการพิสูจน์หลักฐานทางนิติวิทยาศาสตร์พี. คิวเบนซิส.

วัสดุและวิธีการ

การเก็บตัวอย่าง

คัดเลือกวัสดุหลายชนิดเพื่อวิเคราะห์เชิงทดลอง เห็ดหลอนประสาทของพี. คิวเบนซิส,พี. เมอร์ดาเรีย,Panaeolus papilionaceusและพืชหลอนประสาทของค. ซาติวาเกือบจะถูกรวบรวมมาจากห้องทดลองทางนิติวิทยาศาสตร์ เห็ดป่าและวัสดุจากพืชอื่นๆ ที่ใช้ในการวิเคราะห์ล้วนถูกเก็บกลางแจ้ง ซึ่งมาจากกวางสี ยูนนาน เจียงซู เซี่ยงไฮ้ และสถานที่อื่นๆ ในประเทศจีน ในตอนแรกทุกสายพันธุ์ได้รับการระบุโดยผู้เชี่ยวชาญด้านเชื้อราตามลักษณะทางสัณฐานวิทยา จากนั้นบริเวณ ITS ของเห็ดทั้งหมดจะถูกจัดลำดับและสอดคล้องกับลำดับในศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI) GenBank โดยใช้การค้นหานิวคลีโอไทด์ BLAST https://blast.ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi เพื่อยืนยันสายพันธุ์ของพวกเขา สรุปสัญลักษณ์วัสดุ ชื่อวิทยาศาสตร์ ตระกูล แหล่งที่มา และหมายเลขภาคยานุวัติตารางที่ 1.

ตารางที่ 1.

Psilocybe cubensisและพันธุ์อื่นๆ ที่ใช้ในการศึกษานี้

เครื่องหมายชื่อวิทยาศาสตร์ตระกูลแหล่งที่มาประสาทหลอนหมายเลขภาคยานุวัติ (ตัวตน)
พีซีPsilocybe cubensisStrophariaceaeห้องปฏิบัติการใช่MN893872(100%)
บ่ายโมงPsilocybe merdariaStrophariaceaeห้องปฏิบัติการใช่AB158636(100%)
ซีเนียร์สโตรฟาเรีย รูโกโซแอนนูลาตาStrophariaceaeเซี่ยงไฮ้เลขที่MN893872(100%)
แอพอมานิตา ปารวิปันเทรินาอะมานิทาเซียกวางสีใช่MH508498(100%)
เช่นอะมานิตา ซับโกลโบซ่าอะมานิทาเซียห้องปฏิบัติการใช่MK388157(100%)
บาทโบลบิเทียสตัวสั่นBolbitiaceaeยูนนานใช่KR425521(99.50%)
ที่ลันเมาแห่งเอเชียBoletaceaeยูนนานเลขที่MG030477(99.87%)
ไอจีอิโนไซบี จีโอฟิลลาCortinariaceaeกวางสีใช่FN550916(100%)
กพยิมโนพิลัสทะลุทะลวงCortinariaceaeหูหนานใช่KT368685(100%)
อิลลินอยส์อิโนไซบี ลาเซราCortinariaceaeยูนนานใช่FJ553061(99.08%)
ในแวววาวอย่างไร้เดียงสาCortinariaceaeยูนนานใช่HQ604086(100%)
ระบบปฏิบัติการOudemansiella submucidaMarasmiaceaeกวางสีเลขที่AY804290(99.85%)
พีพีPanaeolus papilionaceusPsathyrellaceaeห้องปฏิบัติการใช่MK439503(99.18%)
รศPsathyrella fimetariaPsathyrellaceaeกวางสีเลขที่MH860432(100%)
แคลิฟอร์เนียCoprinopsis atramentariaPsathyrellaceaeมณฑลเจียงซูเลขที่MN258631(99.56%)
ป้าPanaeolus แห่งแอนทิลลิสPsathyrellaceaeหูหนานใช่MF497586(100%)
ปลPanaeolus sphinctrinusPsathyrellaceaeห้องปฏิบัติการใช่KY559331(99.68%)
ไมซีนาฮีมาโทปัสTricholomataceaeหูหนานเลขที่LT716053(100%)
ซีพีคลิโตไซบี ฟิลโลฟิล่าTricholomataceaeยูนนานใช่MK966602(99.80%)
สำเนาถึงClytopilus โค้งงอTricholomataceaeยูนนานเลขที่MN061316(100%)
คสกัญชา sativaMoraceaeห้องปฏิบัติการใช่
Hsเป็นคนฉลาดโฮมินิแดห้องปฏิบัติการเลขที่

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

การสกัดดีเอ็นเอจีโนม

ไพลีลัสบนเนื้อเห็ดถูกบดให้ละเอียด และสกัด DNA จีโนมของตัวอย่างโดยใช้ DNeasy Plant Pro Kit ตามระเบียบการของผู้ผลิต (Qiagen, Hilden, Germany) เทมเพลตทั้งหมดถูกหาปริมาณด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 2000 (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) วิเคราะห์โดยซอฟต์แวร์ NanoDrop 2.4.7c (NanoDrop Technologies Inc.) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตและเจือจางเป็น 1.0 ng/µL สำหรับเรียลไทม์ การวิเคราะห์ PCR HRM

การเลือกมาร์กเกอร์และการออกแบบไพรเมอร์ PCR

สี่ลำดับที่เกี่ยวข้องกับพี. คิวเบนซิสถูกดาวน์โหลดจากฐานข้อมูล NCBI รวมถึงหน่วยย่อยที่ใหญ่ที่สุดของ RNA polymerase II (RPB1), ยีนฟอสโฟทรานสเฟอเรสที่เกี่ยวข้องกับแอลเอส, ยีนกลีเซอราลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส และการแปล EF1α (tEF1α). ซอฟต์แวร์ Primer Premier 5.0 (Premier Biosoft International, ซานฟรานซิสโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้เพื่อออกแบบไพรเมอร์ PCR สำหรับภูมิภาคที่เลือก ความยาวไพรเมอร์ต้องเท่ากับ 20–30 bp โดยมี aประมาณ 55 °C และปริมาณ GC ที่แตกต่างกันระหว่าง 40% ถึง 60% หากเป็นไปได้ ควรหลีกเลี่ยงกิ๊บติดผม ตัวเอง และเฮเทอโรไดเมอร์ด้วย ไพรเมอร์ถูกสังเคราะห์ที่ Sangon Biotech (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ตรวจปริมาณโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 2000 และเจือจางเป็น 10 µmol/L สัญลักษณ์ไพรเมอร์และข้อมูลรายละเอียดแสดงอยู่ในรายการตารางที่ 2.

ตารางที่ 2.

ไพรเมอร์สำหรับขยายบาร์โค้ด DNA ของPsilocybe cubensisและสายพันธุ์อื่นๆ

เครื่องหมายลำดับไพรเมอร์ (5′→3′)หมายเลขภาคยานุวัติ NCBI (ช่วง)ความยาว (bp)ยีน(°ซ)
พีซี-R1F: CTCTACTCGTTTCGCACCCKC669344246หน่วยย่อยที่ใหญ่ที่สุดของ RNA polymerase II (RPB1)55.90
R: CGCACTCCTCGTTCAGC57.07
พีซี-พีทีF: ATCGGGAGGTTCTGGGMG548657145ฟอสโฟทรานสเฟอเรสที่เกี่ยวข้องกับ Psilocybin54.01
R: CGCAAGTGCGGTTTT53.80
พีซี-3F: CGCTGGTGCTGAATACGกม.273235182กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส54.06
R: CGGAAGCCCTGGAAAG53.45
พีซี-อีเอฟF: TTCATCAAGAAGGTCGGTTACHF91233867คำแปล EF1α (tEF1α)51.75
R: TCTCCGTGCCATCCAG54.63

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

การผสมหลักปฏิกิริยา PCR HRM และการตั้งค่าการวิเคราะห์

ในการศึกษานี้ มีการใช้ Type-it HRM PCR Kit (Qiagen) ในปฏิกิริยา PCR แบบเรียลไทม์ สีย้อมอินเทอร์คาเลติ้งของ Eva GreenTM ได้รับเลือกเพื่อติดตามการสะสมของผลิตภัณฑ์ที่ขยายใหญ่ในระหว่างกระบวนการ PCR และ HRM แบบเรียลไทม์ สเปกตรัมการกระตุ้นและการปล่อยของ EvaGreenTM นั้นใกล้เคียงกับสเปกตรัมของฟลูออเรสซีนมาก โดยมีข้อดีคือไม่มีการยับยั้ง PCR ความสามารถในการผสมผสานที่แข็งแกร่งขึ้น และความแม่นยำในการวิเคราะห์ GC ที่สูงขึ้น [22] ปริมาณมาตรฐานในส่วนผสมมีทั้งหมด 25 µL ซึ่งประกอบด้วย 12.5 µL ของ 2× HRM PCR Master Mix, 9.75 µL ของน้ำปลอด RNase, 1.75 µL ของไพรเมอร์ผสม (10 µmol/L) และ 1 µL ของ DNA แม่แบบ (1 ng/µL ).

Rotor-Gene Q Serious (Qiagen) ถูกนำมาใช้ในการทดลองของเรา สภาวะมาตรฐานของเทอร์โมไซเคิล/การหลอมละลายคือ: พักเริ่มต้นที่ 95 °C เป็นเวลา 5 นาที; จากนั้นหมุนเวียนการสูญเสียสภาพที่ 95 °C เป็นเวลา 10 s, อบอ่อนที่ 55 °C เป็นเวลา 30 s และยืดออกที่ 72 °C เป็นเวลา 10 s วงจรนี้เกิดขึ้นซ้ำ 45 ครั้ง ต่อไป แอมพลิคอนถูกละลายจนถึงทางลาดจาก 65 °C ถึง 95 °C เพิ่มขึ้นทีละ 0.1 °C และรอ 2  วินาทีสำหรับแต่ละขั้นตอน จุดสูงสุดของอุณหภูมิหลอมละลายถูกมองเห็นภายใต้สีเขียวผ่านซอฟต์แวร์ Rotor-Gene Q Serious V2.1.0 โดยการคำนวณอนุพันธ์อันดับหนึ่งที่เป็นลบของค่าเรืองแสงที่รวบรวม (-ดีเอฟ/ดีที) ซึ่งถูกพล็อตในรูปแบบผกผัน

การศึกษาความจำเพาะและความแม่นยำ

ไพรเมอร์สี่ชุดที่ออกแบบมาสำหรับมาร์กเกอร์เป้าหมายของพี. คิวเบนซิสได้รับการทดสอบใน 22 สายพันธุ์ด้วยการวิเคราะห์ PCR HRM แบบเรียลไทม์ ซึ่งรวมถึงเห็ด 20 ชนิดค. ซาติวาและมนุษย์ พารามิเตอร์การผสมหลักถูกดำเนินการสำหรับปฏิกิริยาความจำเพาะทั้งหมด และสภาวะการหลอมเหลวยังคงเป็นมาตรฐานกับแต่ละปฏิกิริยา สำหรับการควบคุมคุณภาพอย่างใดอย่างหนึ่งพี. คิวเบนซิสตัวอย่างถูกเลือกเป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกและตรวจสอบในการทดสอบ HRM แต่ละครั้งของเรา ตัวอย่างกลุ่มควบคุมเชิงลบโดยใช้น้ำปราศจาก RNase ปริมาณเท่ากันยังถูกวิเคราะห์ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน ยิ่งไปกว่านั้น แอมพลิฟายเออร์ PCR ทั้งสี่ตัวของพี. คิวเบนซิสได้รับการวิเคราะห์โดยลำดับ Sanger ซึ่งผลลัพธ์ถูกเปรียบเทียบกับลำดับที่มีอยู่ใน GenBank เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของวิธี HRM

การศึกษาความไวและการทำซ้ำ

เพื่อประเมินความทนทานของวิธี HRM ซึ่งเป็นการเจือจาง DNA ห้าลำดับของพี. คิวเบนซิสจาก 1.0 ng/µL ถึง 62.5 pg/µL (นั่นคือ 1 000, 500, 250, 125 และ 62.5 pg/µL) ถูกเตรียมไว้สำหรับการวิเคราะห์ความไวของวิธีการ ที่ดีเอฟ/ดีทีข้อมูลของแต่ละปฏิกิริยาถูกบันทึกไว้เพื่อการประเมินต่อไปนี้ นอกจากนี้ห้าที่ไม่เกี่ยวข้องและเป็นอิสระพี. คิวเบนซิสตัวอย่างที่ได้จากห้องปฏิบัติการนิติเวชได้รับการตรวจสอบและติดฉลากเป็น a-e การทดลองแบบปกปิดกับตัวอย่างทั้งหมดยังดำเนินการในห้องปฏิบัติการที่ได้รับการรับรองอีกแห่งสำหรับการศึกษาความสามารถในการทำซ้ำ

การวิเคราะห์ส่วนผสม

ในบางกรณีมักจำเป็นต้องทดสอบปริมาณในกระเพาะอาหารหรือส่วนผสมของยาต่างๆ จึงนำไพรเมอร์ทั้ง 4 ชุดมาวิเคราะห์ DNA ของพี. คิวเบนซิสผสมกับฮ. ฉลาดหรือค. ซาติวา. ส่วนผสม DNA ที่ทดสอบในการศึกษาของเรามี DNA ทั้งหมด 1 ng ซึ่งประกอบด้วย 0.5 µL ของพี. คิวเบนซิสDNA (1 ng/µL) และ 0.5 µL ของ DNA ของฮ. ฉลาดหรือค. ซาติวา(1 ng/ไมโครลิตร) สภาวะและการตั้งค่าปฏิกิริยายังคงไม่เปลี่ยนแปลง

มัลติเพล็กซ์ PCR HRM

ต่อไปเราพยายามที่จะปรับปรุงประสิทธิภาพการระบุตัวตนโดยการตรวจจับเครื่องหมาย DNA หลายตัวพร้อมกัน ชุดไพรเมอร์ซึ่งขยายชิ้นส่วน PCR ด้วยต่างกันเกิน 2 °C ให้เลือกในกลุ่มเดียวกัน ไพรเมอร์แต่ละกลุ่มถูกนำไปใช้เพื่อดำเนินการ PCR HRM แบบมัลติเพล็กซ์รายการเดียวพี. คิวเบนซิส. ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมดยังคงอยู่ที่ 25 µL และปริมาตรของน้ำปราศจาก RNase ลดลงและแทนที่ด้วยปริมาตรที่เพิ่มขึ้นของไพรเมอร์ที่เลือก (1.75 µL) เพื่อให้สามารถบรรจุชุดไพรเมอร์หลายชุดไว้ในส่วนผสมปฏิกิริยา PCR เดียว

ผลลัพธ์

การศึกษาความจำเพาะ

ขั้นแรกเราวิเคราะห์ประสิทธิภาพของเครื่องหมาย DNA สี่ตัวบนพี. คิวเบนซิสโดยวิธี HRM กราฟ HRM ลักษณะเฉพาะที่สังเกตได้พี. คิวเบนซิสซึ่งรวมถึงเส้นโค้งการหลอมเหลวแบบปกติและเส้นโค้งอนุพันธ์ของการหลอมละลาย ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 1. ตำแหน่งทั้งหมดให้โปรไฟล์การหลอมเหลวที่ประสบความสำเร็จพี. คิวเบนซิสและสิ่งที่สังเกตได้ของ RNA polymerase II (PC-R1), ยีน phosphotransferase ที่เกี่ยวข้องกับ Psilocybin (PC-PT), glyceraldehyde 3-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส (PC-3), การแปล EF1α (PC-EF) ของพี. คิวเบนซิสคือ 87.93 °C, 82.21 °C, 79.72 °C และ 80.11 °C ตามลำดับ แอมพลิฟายเออร์ PCR ของพี. คิวเบนซิสจากนั้นวิเคราะห์โดยลำดับแซงเจอร์ ข้อมูลลำดับมีความสอดคล้องอย่างสมบูรณ์กับลำดับของเครื่องหมายสี่ตัวของพี. คิวเบนซิสหาได้จาก Genebank ซึ่งแสดงให้เห็นว่าไพรเมอร์ที่ได้รับการออกแบบนั้นกำลังไพรเมอร์ที่บริเวณเป้าหมาย

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

รูปที่ 1.

การวิเคราะห์การหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM) ของเครื่องหมาย DNA สี่ตัวPsilocybe cubensis. (A) พล็อตเส้นโค้งที่หลอมละลาย; (B) พีคของการหลอมเหลวที่ทำให้เป็นมาตรฐาน RNA โพลีเมอเรส II: PC-R1; ยีนฟอสโฟทรานสเฟอเรสที่เกี่ยวข้องกับแอลเอส: PC-PT; กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส: PC-3; การแปล EF1α: PC-EF

ไพรเมอร์ที่ใช้ข้างต้นได้รับการทดสอบกับ 22 สายพันธุ์เพื่อเปรียบเทียบความจำเพาะของไพรเมอร์แต่ละชุด รวมทั้งพี. คิวเบนซิส, เห็ดที่เกี่ยวข้อง 19 ชนิด,ค. ซาติวาและฮ. ฉลาด(รูปที่เสริม S1). ที่สังเกตสำหรับทุกสายพันธุ์โดยสรุปไว้ในตารางที่ 3. ชุดไพรเมอร์ PC-R1 และ PC-EF ประสบความสำเร็จในการขยายสปีชีส์ 14 และ 11 ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ถึงความจำเพาะที่ค่อนข้างต่ำของชุดไพรเมอร์สองชุด ชุดไพรเมอร์ PC-PT ขยายสปีชีส์ได้สำเร็จ 8 สปีชีส์ และชุดไพรเมอร์ PC-3 ขยายสปีชีส์ได้เพียง 5 สปีชีส์เท่านั้น ไม่พบการขยายสัญญาณจากPsathyrella fimetaria,Coprinopsis atramentaria,ค. ซาติวาและฮ. ฉลาดในขณะที่เครื่องหมายสี่ตัวถูกขยายทั้งหมดสำเร็จพี. คิวเบนซิสและสโตรฟาเรีย รูโกโซแอนนูลาตา. สาเหตุอาจเป็นเพราะทั้งคู่อยู่ในวงศ์ Strophariaceae และมีความสัมพันธ์กันอย่างใกล้ชิด แม้จะมีข้อจำกัดนี้ แต่ก็มีความแตกต่างที่สำคัญในค่า m ของ PC-3 และ PC-EF ระหว่างพี. คิวเบนซิสและส. รูโกโซอันนูลาตาซึ่งให้หลักฐานเพียงพอสำหรับการเลือกปฏิบัติของทั้งสองสายพันธุ์นี้ ไม่แสดงผลลัพธ์การวิเคราะห์บนตัวอย่างกลุ่มควบคุมเชิงลบ (รูปที่ S2 เพิ่มเติม).

ตารางที่ 3.

ผลลัพธ์ของอุณหภูมิหลอมเหลว () ของการหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM) สำหรับสายพันธุ์ที่รวมอยู่ทั้งหมด

สายพันธุ์PC-R1 (°ซ)ของ PC-PT (°C)ของ PC-3 (°C)PC-EF (°C)
Psilocybe cubensis87.93 ± 0.1282.21 ± 0.1479.72 ± 0.1280.11 ± 0.19
Psilocybe merdaria86.90 ± 0.2087.68 ± 0.2781.52 ± 0.24
สโตรฟาเรีย รูโกโซแอนนูลาตา88.00 ± 0.2281.53 ± 0.1883.98 ± 0.0581.55 ± 0.25
อมานิตา ปารวิปันเทรินา86.23 ± 0.2079.92 ± 0.26
อะมานิตา ซับโกลโบซ่า85.70 ± 0.22
โบลบิเทียสตัวสั่น87.65 ± 0.27
ลันเมาแห่งเอเชีย85.01 ± 0.09
อิโนไซบี จีโอฟิลลา88.80 ± 0.2885.05 ± 0.13
ยิมโนพิลัสทะลุทะลวง88.95 ± 0.1880.18 ± 0.2683.48 ± 0.11
อิโนไซบี ลาเซรา89.15 ± 0.24
แวววาวอย่างไร้เดียงสา88.57 ± 0.1385.18 ± 0.03
Oudemansiella submucida80.60 ± 0.23
Panaeolus papilionaceus87.02 ± 0.1887.72 ± 0.2374.40 ± 0.05
Psathyrella fimetaria
Coprinopsis atramentaria
Panaeolus แห่งแอนทิลลิส85.55 ± 0.2679.93 ± 0.1280.21 ± 0.23
Panaeolus sphinctrinus86.82 ± 0.2279.53 ± 0.12
ไมซีนาฮีมาโทปัส80.02 ± 0.15
คลิโตไซบี ฟิลโลฟิล่า86.05 ± 0.07
Clytopilus โค้งงอ87.95 ± 0.2082.86 ± 0.2583.61 ± 0.07
กัญชา sativa
เป็นคนฉลาด

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

การศึกษาความไว การทำซ้ำ และความสอดคล้อง

ประสิทธิภาพในการระบุชุดไพรเมอร์สี่ชุดได้รับการตรวจสอบตลอดการทดลองอิสระหลายครั้งและตัวอย่างที่มีความเข้มข้นของ DNA ที่แตกต่างกัน ประการแรก การเจือจางความเข้มข้นของ DNA ตามลำดับ (1 000, 500, 250, 125 และ 62.5 pg/µL) ของพี. คิวเบนซิสถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความไวของวิธี PCR HRM ดังแสดงในรูปที่ S3 เพิ่มเติมและรูปที่ 2จุดหลอมเหลวที่สมบูรณ์สามารถหาได้จากเจือจางทั้งหมด ที่ดีเอฟ/ดีทีค่าจะลดลงเมื่อความเข้มข้นของตัวอย่าง DNA อยู่ระหว่าง 1,000 ลงไปถึง 125 pg/µL โดยที่ดีเอฟ/ดีทีลดลงเร็วยิ่งขึ้นอีกเมื่อความเข้มข้นของ DNA ลดลงเหลือ 62.5 pg/µL

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

รูปที่ 3.

เจือจางของPsilocybe cubensisด้วยไพรเมอร์ (a) PC-R1, (b) PC-PT, (c) PC-3 และ (d) PC-EF ที่ความเข้มข้น 1000, 500, 250, 125 และ 62.5 pg/µL โดยใช้สีย้อมระหว่าง Eva Green™ .

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

รูปที่ 2.

ที่ดีเอฟ/ดีทีค่าของผลิตภัณฑ์ PCR ต่างๆ ที่สังเกตได้ที่ 1,000, 500, 250, 125 และ 62.5 pg/µL DNA สำหรับPsilocybe cubensis.

เพื่อประเมินความสามารถในการทำซ้ำของการทดสอบของเรา ตัวอย่างทั้งหมดถูกขยายในห้องปฏิบัติการอื่นและทดสอบโดย HRM เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่สอดคล้องกับของเรา ห้าที่ไม่เกี่ยวข้องและเป็นอิสระพี. คิวเบนซิสตัวอย่างยังได้รับการวิเคราะห์โดย HRM โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินความสอดคล้องของวิธี HRM (รูปที่S4 เพิ่มเติม). ที่สังเกตของภูมิภาคเป้าหมาย PC-R1, PC-PT, PC-3 และ PC-EF คือ (87.93±0.12) °C, (82.21±0.14) °C, (79.72±0.12) °C และ (80.11±0.19 ° C) ตามลำดับ ซึ่งแสดงให้เห็นความเสถียรสูงของวิธีการของเรา

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

รูปที่ 5.

ความสามารถในการทำซ้ำของชุดไพรเมอร์ (a) PC-R1, (b) PC-PT, (c) PC-3 และ (d) PC-EF บนPsilocybe cubensis. a (แดง), b (เขียว), c (น้ำเงิน), d (ดำ) และ e (ม่วง)

การวิเคราะห์สารผสม

ในสารผสมนั้น บริเวณเป้าหมาย DNA สี่แห่งของพี. คิวเบนซิสถูกขยายออกไปอย่างสมบูรณ์ กราฟ HRM และค่าของสารผสมทั้งสองเกือบจะทับซ้อนกันกับการควบคุมของสารเดี่ยวพี. คิวเบนซิสหรือผันผวนเฉพาะระหว่างช่วงค่าเฉลี่ยกับส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (รูปที่ 3). ที่สังเกตของเครื่องหมาย DNA ในสารผสมที่มีฮ. ฉลาดอยู่ที่ 87.89 °C (PC-R1), 82.43 °C (PC-PT), 79.85 °C (PC-3) และ 80.12 °C (PC-EF) ในขณะที่ค่าที่สังเกตได้ในสารผสมที่มีค. ซาติวาอยู่ที่ 87.85 °C (PC-R1), 82.22 °C (PC-PT), 79.74 °C (PC-3) และ 80.14 °C (PC-EF) ตามลำดับ

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

รูปที่ 3.

เส้นโค้งการหลอมละลายความละเอียดสูง (HRM) ของPsilocybe cubensisในสารผสม (ผสมกับกัญชา sativaหรือเป็นคนฉลาด) ด้วยไพรเมอร์สี่ตัวที่ได้รับการออกแบบ

มัลติเพล็กซ์ PCR HRM

เครื่องหมายที่เลือกหลายตัวถูกขยายในปฏิกิริยา PCR แบบมัลติเพล็กซ์ ซึ่งรวมถึงห้ากลุ่มของ PC-R1/PC-PT/PC-3, PC-R1/PC-3, PC-R1/PC-PT, PC-PT/PC- 3 และ PC-R1/PC-EF ดังที่ปรากฏอยู่ในรูปที่เสริม S5คู่ไพรเมอร์ทั้งหมดภายในปฏิกิริยา PCR มัลติเพล็กซ์เดียวกันดำเนินการกราฟการหลอมเหลวที่ประสบความสำเร็จและเป็นอิสระ และค่าที่ได้รับใน multiplex PCR HRM สอดคล้องกับข้อมูลข้างต้น

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

รูปที่ 7.

การทดสอบ Multiplex PCR HRM โดยใช้ Eva Green™Psilocybe cubensis. (a) PC-R1 + PC-PT + PC-3, (b) PC-R1 + PC-3, (c) PC-R1 + PC-PT, (d) PC-3 + PC-PT และ (e ) PC-R1 + PC-EF

การอภิปราย

ในบรรดาเครื่องหมายสี่ตัวที่เลือก ได้แก่ กลีเซอราลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส และtEF1αก่อนหน้านี้มีการเลือกยีนเพื่อกำหนดเป้าหมายพี. คิวเบนซิสในการศึกษาของ Cowan และ Elkins [20], ในขณะที่RPB1และไซโลไซบินมีการใช้ยีนฟอสโฟทรานสเฟอเรสที่เกี่ยวข้องกับการจำแนกเห็ดเป็นครั้งแรก ในการศึกษาความจำเพาะของเรา ชุดไพรเมอร์สี่ชุดที่ออกแบบมาเพื่อขยายเครื่องหมายทั้งสี่ได้รับการทดสอบใน 22 ชนิด รวมถึงเห็ด พืช และมนุษย์ และไพรเมอร์ทุกคู่มีความจำเพาะที่แตกต่างกัน ในบรรดาไพรเมอร์เหล่านี้ ชุดไพรเมอร์ PC-3 ขยายกลีเซอราลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต เป็นไพรเมอร์ที่มีความเฉพาะเจาะจงที่สุด ซึ่งขยายเพียง 5 ชนิดเท่านั้น ได้แก่พี. คิวเบนซิสในขณะที่ PC-R1 กำลังขยายเสียงRPB1น้อยที่สุดซึ่งขยายออกไปพี. คิวเบนซิสและอีก 13 ชนิด นอกจากนี้,พี. คิวเบนซิสและส. รูโกโซอันนูลาตาทั้งสองประสบความสำเร็จในการขยายโดยชุดไพรเมอร์ทั้งหมดซึ่งอาจเป็นผลมาจากข้อเท็จจริงที่ว่าพี. คิวเบนซิสและส. รูโกโซอันนูลาตาอยู่ในวงศ์เดียวกัน Strophariaceae แม้ว่าการผสมไพรเมอร์ทั้ง 4 ชุดจะไม่ได้จำเพาะต่อสายพันธุ์ก็ตามพี. คิวเบนซิสเราสามารถแยกแยะได้ชัดเจนระหว่างสองสายพันธุ์นี้โดยพิจารณาจากค่า PC-3 และ PC-EF ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงความสามารถของไพรเมอร์ และการวิเคราะห์ HRM ที่อิงจากไพรเมอร์เหล่านี้อาจเพิ่มความละเอียดของวิธีการระบุตัวตนในปัจจุบันสำหรับพี. คิวเบนซิส.

การทดสอบความไวยังดำเนินการโดยการเปรียบเทียบดีเอฟ/ดีทีค่ากราฟการหลอมละลายที่ได้จากความเข้มข้นต่างๆ ของพี. คิวเบนซิส. สำหรับชุดไพรเมอร์ PC-R1, PC-PT และ PC-3 ความเข้มข้นของ DNA ทั้งหมดทำให้เกิดกราฟการหลอมละลายที่สมบูรณ์ แม้ว่า DNA 62.5 pg/µL จะสร้างพีคที่ค่อนข้างต่ำก็ตาม อย่างไรก็ตาม สำหรับชุดไพรเมอร์ PC-EF นั้นดีเอฟ/ดีทีค่าของความเข้มข้นทั้งหมดมีขนาดเล็กอย่างเห็นได้ชัด และ 62.5 pg/µL ให้ค่าน้อยกว่า 0.5 ซึ่งบ่งชี้ว่า 62.5 pg/µL อาจใกล้กับขีดจำกัดล่างของ PC-EF (รูปที่ 2). แนวโน้มที่คล้ายกันนี้ถูกพบในการศึกษาความสามารถในการทำซ้ำด้วย จุดหลอมเหลวที่ต่ำของ PC-EF อาจเนื่องมาจากความยาวที่สั้นกว่าของชิ้นส่วน PCR ของมัน พร้อมด้วยสัมพรรคภาพการจับกับฟลูออเรสเซนต์ที่ต่ำกว่า [22] แต่ข้อบกพร่องนี้จะกลายเป็นข้อได้เปรียบเมื่อประเมินตัวอย่างเก่าและเสื่อมโทรม เมื่อนำมารวมกัน สามารถใช้ชุดไพรเมอร์สี่ชุดร่วมกันเพื่อตรวจจับตัวอย่างในชีวิตจริงที่มีความเข้มข้นต่ำมากได้

เปิดในหน้าต่างแยกต่างหาก

รูปที่ 2.

ที่ดีเอฟ/ดีทีค่าของผลิตภัณฑ์ PCR ต่างๆ ที่สังเกตได้ที่ 1,000, 500, 250, 125 และ 62.5 pg/µL DNA สำหรับPsilocybe cubensis.

นอกเหนือจากการประเมินความไวและความสามารถในการทำซ้ำแล้ว ชุดไพรเมอร์ทั้งสี่ชุดยังถูกวิเคราะห์บนของผสม DNA ที่ประกอบด้วยพี. คิวเบนซิสและฮ. ฉลาดหรือค. ซาติวาเป็นหนึ่งในสารหลอนประสาทที่พบบ่อยที่สุดและฮ. ฉลาดอาจมีดีเอ็นเอปะปนอยู่ด้วยพี. คิวเบนซิสในปริมาณในกระเพาะอาหารซึ่งเป็นทั้งตัวอย่างที่พบบ่อยในคดีค้ายาเสพติดทางนิติเวช ในการวิเคราะห์ส่วนผสมของเรา เราใช้ตัวอย่างควบคุมของสารเดี่ยวพี. คิวเบนซิสเป็นข้อมูลอ้างอิง ไม่พบความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่างของผสม DNA และการควบคุมของเดี่ยวพี. คิวเบนซิสและไม่พบสิ่งใดระหว่างสารผสมสองชนิด (รูปที่ 3). ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาความจำเพาะของเรา เนื่องจากไม่พบการขยายสัญญาณฮ. ฉลาดและค. ซาติวา. ผลที่ได้จากการทดสอบส่วนผสมพบว่าชุดไพรเมอร์ทั้ง 4 ชุดที่วิเคราะห์โดยใช้เทคโนโลยี HRM สามารถตรวจจับ DNA ของสารได้อย่างชัดเจนพี. คิวเบนซิสใน DNA ผสม แต่ไม่สามารถตรวจพบ DNA ของสายพันธุ์อื่นภายในสารผสมได้ การทดสอบส่วนผสมของเราแสดงให้เห็นถึงความจำเพาะของไพรเมอร์พี. คิวเบนซิสแต่ยังเผยให้เห็นข้อจำกัดของวิธีการนี้ในการตรวจสอบสายพันธุ์อื่นที่มีอยู่โดยสารผสม ในที่สุด เราพยายามที่จะปรับปรุงประสิทธิภาพของวิธีการระบุตัวตนของเรา ดังนั้นเราจึงดำเนินการวิเคราะห์ PCR HRM แบบมัลติเพล็กซ์พี. คิวเบนซิส. ไพรเมอร์ที่เลือกทั้งหมดผสมในปฏิกิริยา PCR แบบมัลติเพล็กซ์เดียวทำให้เกิดกราฟ HRM ที่แตกต่างกันและค่าที่บ่งบอกถึงความเป็นไปได้ของ multiplex PCR HRM ที่ใช้สำหรับตัวอย่างในชีวิตจริง

เครื่องมือของ HRM ได้รับการติดตั้งอย่างกว้างขวางในห้องปฏิบัติการนิติเวช ซึ่งคุ้มค่าและเป็นมิตรกับผู้ใช้สำหรับช่างเทคนิค [23–25] การทดสอบ PCR HRM สำหรับพี. คิวเบนซิสการระบุตัวตนยังเป็นกลยุทธ์ที่เชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพ ซึ่งสามารถทำหน้าที่เป็นการทดสอบเพื่อยืนยันในการตรวจจับการมีอยู่ของพี. คิวเบนซิสดีเอ็นเอ. ในการศึกษานี้ เครื่องหมาย DNA สี่ตัวของพี. คิวเบนซิสขยายด้วยชุดไพรเมอร์เฉพาะเจาะจงวิเคราะห์ด้วย PCR แบบเรียลไทม์พร้อมขั้นตอนเพิ่มเติมของการทดสอบ HRM ซึ่งประเมินลักษณะของเครื่องหมายเป้าหมายอย่างชัดเจนและแยกแยะพี. คิวเบนซิสจากสายพันธุ์อื่น นอกจากนี้ ผลการศึกษาการตรวจสอบความถูกต้องยังยืนยันความไว การทำซ้ำของไพรเมอร์เฉพาะเหล่านี้ และประสิทธิภาพในการจำแนกไพรเมอร์ในสารผสม ความสำคัญของวิธีนี้อาจถูกจำกัดด้วยขนาดตัวอย่างที่เล็กในการศึกษาความจำเพาะของเรา ชุดไพรเมอร์ทั้ง 4 ชุดได้รับการทดสอบใน 22 สายพันธุ์เท่านั้น ซึ่งทำให้จำเป็นต้องมีการศึกษาในอนาคตด้วยตัวอย่างเพิ่มเติมจากสายพันธุ์ต่างๆ เพื่อประเมินความจำเพาะของไพรเมอร์เหล่านี้เพิ่มเติม นอกจากนี้ วิธีการระบุชนิดเฉพาะสายพันธุ์นี้ดูเหมือนจะมีข้อจำกัดในสารผสมเพียงอย่างเดียวพี. คิวเบนซิสสามารถตรวจพบได้ ซึ่งต้องการวิธีการเสริมในการระบุตัวตนค.ซาติวาและสารหลอนประสาทอื่นๆ

บทสรุป

ในการศึกษานี้ เราได้ออกแบบชุดไพรเมอร์สี่ชุดรวมกัน และตรวจสอบวิธีการระบุชนิดใหม่โดยเฉพาะพี. คิวเบนซิส. การทดสอบ HRM ใช้เพื่อวิเคราะห์แอมพลิคอนของไพรเมอร์สี่ชุด ซึ่งต่อมาได้รับการทดสอบกับเห็ดประสาทหลอนหลายชนิด รวมถึง Psilocybe, Panaeolus และ Gymnopilus และเห็ดและพืชบางชนิดที่เกี่ยวข้อง จากการทดสอบ PCR HRM นี้ เราแยกแยะได้สำเร็จพี. คิวเบนซิสจากสายพันธุ์อื่น นอกจากนี้ การทดสอบส่วนผสมของเรายังชี้ให้เห็นว่าชุดไพรเมอร์ทั้งสี่ชุดนี้สามารถตรวจจับ DNA ได้อย่างชัดเจนพี. คิวเบนซิสใน DNA ผสม แต่ไม่สามารถตรวจพบ DNA ของสายพันธุ์อื่นภายในสารผสมได้ ในที่สุด การทดสอบ PCR แบบมัลติเพล็กซ์ของเราระบุว่าชุดไพรเมอร์ที่แตกต่างกันที่ผสมในปฏิกิริยาเดียวสามารถสร้างผลลัพธ์ HRM ที่แตกต่างกัน ซึ่งสามารถนำไปใช้สำหรับการตรวจสอบตัวอย่างในชีวิตจริงอย่างรวดเร็ว

การทดสอบ PCR HRM สำหรับพี. คิวเบนซิสการระบุตัวตนเป็นกลยุทธ์ที่เชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพ ซึ่งสามารถทำหน้าที่เป็นการทดสอบเพื่อยืนยันในการตรวจจับการมีอยู่ของพี. คิวเบนซิสดีเอ็นเอ. การศึกษาของเราให้แนวทางที่ใช้ HRM เพื่อยืนยันพี. คิวเบนซิสซึ่งจะเป็นเครื่องมือระดับโมเลกุลที่ทรงพลังในการติดตามเครือข่ายการจำหน่ายและหลักฐานคดีอาญา

วัสดุเสริม

วัสดุเสริม:

คลิกที่นี่เพื่อดูไฟล์ข้อมูลเพิ่มเติม(7.7K, PNG)

ผลงานของผู้เขียน

เสี่ยวฉุน จางเขียนต้นฉบับหลักและวิเคราะห์ผลลัพธ์ Huan Yu, Ziwei Wang, Yan Shi และ Ping Xiang รวบรวมและเตรียมตัวอย่าง เสี่ยวชุน จาง, ชี่หยาง, รัวเฉิงเซี่ย และอี้หลิงชวู่ ได้ทำการทดลอง รุ่ยหยางเต๋าช่วยแก้ไขต้นฉบับ Suhua Zhang และ Chengtao Li ออกแบบการศึกษานี้ ผู้เขียนทุกคนตรวจสอบต้นฉบับและอนุมัติข้อความสุดท้าย

การปฏิบัติตามมาตรฐานทางจริยธรรม

บทความนี้ไม่มีการศึกษาใดๆ กับผู้เข้าร่วมที่เป็นมนุษย์หรือสัตว์ที่ดำเนินการโดยผู้เขียนคนใดคนหนึ่ง

คำชี้แจงการเปิดเผยข้อมูล

ผู้เขียนขอประกาศว่าพวกเขาไม่มีผลประโยชน์ในการแข่งขัน

การศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนจากทุนสนับสนุนจากโครงการวางแผนสังคมในพื้นที่เซี่ยงไฮ้ (หมายเลขทุน 19dz1200600), มูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน (หมายเลขทุน 81930056 และ 81625013) และโครงการสนับสนุนผู้มีความสามารถพิเศษเยาวชนแห่งชาติ (หมายเลขทุน WRQB2019)

อ้างอิง

1.Kallifatidis B, Borovicka J, Stranska J, และคณะ..การวิเคราะห์ไมโครแซทเทลไลท์สุ่มขยายฟลูออเรสเซนต์ (F-RAMS) ของเห็ดในฐานะเครื่องมือสืบสวนทางนิติวิทยาศาสตร์.Foren Sci Int Genet. 2014;9:25–32. [ผับเมด][Google Scholar]

2.Solano J, Anabalon L, Figueroa S, และคณะเชื้อราประสาทหลอน (ไซโลไซบี เอสพี.) การรับรองความถูกต้องในกรณีการค้ายาผิดกฎหมาย: สปอร์วิทยา การวิเคราะห์ระดับโมเลกุล และการระบุสารออกฤทธิ์ทางจิต.ความยุติธรรมทางวิทยาศาสตร์. 2019;59:102–108. [ผับเมด][Google Scholar]

3.Kowalczyk M, Sekuła A, Mleczko P, และคณะ..ลักษณะการปฏิบัติของการจำแนกทางพันธุกรรมของเห็ดหลอนประสาทและเห็ดพิษอื่นๆ เพื่อวัตถุประสงค์ทางคลินิกและทางนิติเวช.โครเอเชีย เมด เจ. 2558;56:32–40.[บทความฟรี PMC][ผับเมด][Google Scholar]

4.โมริตะ 1, โอยามะ เอช, คิกุจิ วาย และอื่นๆการตรวจสอบทางอิมมูโนเคมีของแอลเอสโลไซบินและแอลเอสโลซินเพื่อระบุเห็ดที่ทำให้เกิดอาการประสาทหลอน.J Pharm Biomed ก้น. 2020;190:113485. [ผับเมด][Google Scholar]

5.ความเจ็บปวด S, Batisse A, Ingrand I และคณะการบริโภคพืชและเห็ดที่ทำให้เกิดอาการประสาทหลอนโดยนักศึกษามหาวิทยาลัยในฝรั่งเศส: การศึกษานำร่อง.กดด้วย. 2561;47:1023–1205. [ผับเมด][Google Scholar]

6.คาร็อด-อาร์ตัล เอฟเจ. ยาหลอนประสาทในวัฒนธรรม Mesoamerican ก่อนโคลัมเบีย.ประสาทวิทยา. 2558;30:42–49. [ผับเมด][Google Scholar]

7.Babakhanian RV, Bushuev ES, Kazankov SP และอื่น ๆลักษณะทางพิษวิทยาของการเป็นพิษจากเห็ดที่มีสารแอลเอสดี.สุด ๆ กับผู้เชี่ยวชาญ. 1997;40:20–22. [ผับเมด][Google Scholar]

8.Tylš F, Páleníček T, Horáček J.Psilocybin—บทสรุปความรู้และมุมมองใหม่ๆ.ยูโร Neuropsychopharmacol. 2014;24:342–356. [ผับเมด][Google Scholar]

9.Anastos N, Lewis SW, Barnett NW และคณะการหาปริมาณแอลเอสโลซินและแอลเอสโลไซบินในเห็ดที่ทำให้เกิดอาการหลอนประสาทโดย HPLC โดยใช้โพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนตที่เป็นกรดแบบรีเอเจนต์คู่และระบบตรวจจับเคมีเรืองแสงทริส(2,2’-ไบไพริดิล)รูทีเนียม(II).เจ นิติวิทยาศาสตร์. 2549;51:45–51. [ผับเมด][Google Scholar]

10.Saito K, Toyo'oka T, Kato M, และคณะ..การหาปริมาณแอลเอสในเห็ดหลอนประสาทโดยโครมาโทกราฟีของเหลวแบบรีเวิร์สเฟสพร้อมการตรวจจับเรืองแสง.ความสามารถพิเศษ. 2548;66:562–568. [ผับเมด][Google Scholar]

11.คริสเตียนเซ่น อัล, รัสมุสเซ่น เคอี..การคัดกรองเห็ดหลอนประสาทด้วยโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงและการตรวจจับหลายรายการ.เจ โครมาโตโกร. 1983;270:293–299. [ผับเมด][Google Scholar]

12.โดย Cräutlein M, Korpelainen H, Pietiläinen M, และคณะบาร์โค้ด DNA: เครื่องมือสำหรับการระบุอนุกรมวิธานที่ดีขึ้นและการตรวจจับความหลากหลายของสายพันธุ์.อนุรักษ์นักอนุรักษ์ชีวภาพ. 2554;20:373–389.[Google Scholar]

13.Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, และคณะ..ภูมิภาคตัวเว้นวรรคถอดรหัสภายในไรโบโซมนิวเคลียร์ (ITS) เป็นเครื่องหมายบาร์โค้ด DNA สากลสำหรับเชื้อรา.Proc Natl Acad Sci U S A. 2555;109:6241–6246.[บทความฟรี PMC][ผับเมด][Google Scholar]

14.บาดอตติ เอฟ, เด โอลิเวร่า เอฟเอส, การ์เซีย ซีเอฟ, และคณะประสิทธิผลของระบบ ITS และภูมิภาคย่อยในฐานะเครื่องหมายบาร์โค้ด DNA ในการจำแนกเชื้อรา Basidiomycota (เชื้อรา).บีเอ็มซี ไมโครไบโอล. 2560;17:42.[บทความฟรี PMC][ผับเมด][Google Scholar]

15.นูเจนท์ KG, ซาวิลล์ BJ..การวิเคราะห์ทางนิติเวชของเชื้อราที่ทำให้เกิดอาการประสาทหลอน: วิธีการที่ใช้ DNA.ฟอเรน วิทย์ อินเตอร์เนชั่นแนล. 2547;140:147–157. [ผับเมด][Google Scholar]

16.รีบ วี, ลุตโซนี เอฟ, รูซ์ ซี..ผลงานของRPB2สู่การศึกษาสายวิวัฒนาการหลายจุดของยูแอสโคไมซีต (Pezizomycotina, Fungi) โดยเน้นเป็นพิเศษเกี่ยวกับ Acarosporaceae ที่ก่อตัวเป็นไลเคน และวิวัฒนาการของ polyspory.โมล ไฟโลเจเน็ต อีโวล. 2547;32:1036–1060. [ผับเมด][Google Scholar]

17.Matheny PB, Liu YJ, Ammirati JF และคณะโดยใช้RPB1ลำดับเพื่อปรับปรุงการอนุมานสายวิวัฒนาการในเห็ด (Inocybe, Agaricales).ฉันคือเจบอท. 2545;89:688–698. [ผับเมด][Google Scholar]

18.Borna T, Salami SA, Shokrpour M..การวิเคราะห์เส้นโค้งการหลอมละลายที่มีความละเอียดสูงเผยให้เห็น SNP ในยีน cannabinoid ที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับกัญชาประเภทยาและไม่ใช่ยา.เทคโนโลยีชีวภาพ อุปกรณ์เทคโนโลยีชีวภาพ. 2560;31:1–7.[Google Scholar]

19.Elkins KM, เปเรซ ACU, Quinn AA..บัตรประจำตัวทั้งสี่พร้อมกัน"กฎหมายสูงสุด"พันธุ์พืชในการทดสอบการหลอมละลายความละเอียดสูง PCR แบบมัลติเพล็กซ์.เจ ฟอเรน วิทย์. 2560;62:593–601. [ผับเมด][Google Scholar]

20.โคแวน เอเอฟ, เอลกินส์ KM.การตรวจจับและระบุตัวตนของPsilocybe cubensisDNA โดยใช้การทดสอบการหลอมละลายที่มีความละเอียดสูงของปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์.เจฟอเรน วิทย์. 2561;63:1500–1505. [ผับเมด][Google Scholar]

21.Lu S, Mirchevska G, Phatak SS, และคณะ..การประเมินการแปรปรวนตามเวลาแบบไดนามิกของกราฟหลอมเหลวที่มีความละเอียดสูงให้ตัวชี้วัดที่มีประสิทธิภาพสำหรับการระบุเชื้อรา.กรุณาหนึ่ง. 2560;12:e0173320.[บทความฟรี PMC][ผับเมด][Google Scholar]

22.เหมา เอฟ, เหลียง วาย, ซิน เอ็กซ์..การแสดงคุณลักษณะของ EvaGreen และความหมายของคุณสมบัติทางเคมีกายภาพสำหรับการใช้งาน qPCR.บีเอ็มซี ไบโอเทคโนโลยี. 2550;7:76.[บทความฟรี PMC][ผับเมด][Google Scholar]

23.Maeta K, Ochi T, Tokimoto K, และคณะ..การจำแนกชนิดเห็ดพิษปรุงสุกอย่างรวดเร็วโดยใช้ PCR แบบเรียลไทม์.แอพพลิเคชั่น เอ็นไวรอน ไมโครไบโอล. 2551;74:3306–3309.[บทความฟรี PMC][ผับเมด][Google Scholar]

24.นิคลาส JA, Noreault-Conti T, Buel E..การพัฒนาวิธีการโปรไฟล์ที่รวดเร็วและง่ายดายสำหรับการคัดกรองตัวอย่างโดยใช้การหลอม STR ที่มีความละเอียดสูง (HRM).เจ ฟอเรน วิทย์. 2555;57:478–488. [ผับเมด][Google Scholar]

25.โคแวน เอเอฟ, เอลกินส์ KM.การตรวจจับและระบุกระท่อม (มิทราจิน่า สวยๆครับ) และกัญชา (กัญชา sativa) โดยการทดสอบปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ที่มีความละเอียดสูง.เจ ฟอเรน วิทย์. 2020;65:52–60. [ผับเมด][Google Scholar]

บทความจากการวิจัยทางนิติวิทยาศาสตร์ได้รับความอนุเคราะห์จากสำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด

การจำแนก Psilocybe cubensis แบบหลายตำแหน่งโดยการหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM) (2024)

References

Top Articles
Latest Posts
Article information

Author: Greg Kuvalis

Last Updated:

Views: 6132

Rating: 4.4 / 5 (75 voted)

Reviews: 90% of readers found this page helpful

Author information

Name: Greg Kuvalis

Birthday: 1996-12-20

Address: 53157 Trantow Inlet, Townemouth, FL 92564-0267

Phone: +68218650356656

Job: IT Representative

Hobby: Knitting, Amateur radio, Skiing, Running, Mountain biking, Slacklining, Electronics

Introduction: My name is Greg Kuvalis, I am a witty, spotless, beautiful, charming, delightful, thankful, beautiful person who loves writing and wants to share my knowledge and understanding with you.